A traditional medicine, respiratory detox shot (RDS), inhibits the infection of SARS-CoV, SARS-CoV-2, and the influenza A virus in vitro
Brian Hetrick1, Dongyang Yu2, Adeyemi A. Olanrewaju1, Linda D. Chilin1, Sijia He1, Deemah Dabbagh1,Ghaliah Alluhaibi1, Yuan - Chun Ma3, Lewis A. Hofmann4, Ramin M. Hakami1 and Yuntao Wu1*
▋概要
文化背景：目前亦然肆虐世界各地的取而代之型冠状HIV得病 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个国家政府和地区大流行起来，截至 2021 年 4 月初已所致高达 1.28 亿人传染，高达 280 万人遇害。局限性，尚无可有效增加 COVID-19 无故率的治疗步骤。我们数据归纳了一种基本上的之前药用药剂型——破除肺毒用药液 (RDS) 的潜在抑制冠状HIV活性，该用药液主要混搭物为的西方医学基本上之前常用治疗腹腔得病因的之前肉桂。
结果：RDS 诱发 SARS-CoV 极快HIV、SARS-CoV-2 极快HIV、混搭乙型HIV-SARS-CoV-2(Ha-CoV-2) 骗型HIV以及传染性 SARS-CoV-2 和引申的 Ha-CoV-2 变型HIV (B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.429、B.1.2、B.1.494、B.1.1.207、B.1.258 和 B.1.1.298) 对靶肝细胞的传染。我们大幅度检验了 RDS 可以反之亦然灭活 SARS-CoV-2 HIV微粒的传染性。此外，我们见到 RDS 还可阻挠乙型肺炎HIV对靶肝细胞的传染。
结论：RDS 可较广诱发肺部HIV传染。链接：SARS-CoV-2，COVID-19，冠状HIV，抑制HIV治疗，破除肺毒用药液，基本上之前药，SARS-CoV，乙型肺炎，Ha-CoV-2，SARS-CoV-2 骗型HIV
▋文化背景
目前亦然肆虐世界各地的取而代之型冠状HIV得病 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个国家政府和地区大流行起来，截至 2021 年 4 月初已所致高达 1.28 亿人传染，高达 280 万人遇害。局限性，尚无可有效增加 COVID-19 无故率的治疗步骤。取而代之出现的 COVID-19 HIV得病原体为冠状HIV SARS-CoV-2[1]，是 SARS-CoV 在比较严重急性呼吸综合征特别冠状HIV多样之前的姊妹HIV[2,3]。SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 最初都是在之前国见到的；SARS-CoV HIV于 2002 年 11 月初在广东省首次被见到[4-6]，SARS-CoV-2 则于 2019 年 12 月初在武汉首次被见到[1,7,8]。在之前国，这两次由冠状HIV引起的疫情之前，之前药外被较广用于，用以紧急补救冠状HIV引起的得病因。对于局限性的 COVID-19 大流行起来，之前国有高达 85% 的 SARS-CoV-2 传染患儿接纳了基本上之前医药治疗（9，10）。许多用于的之前药到底十分相似有效的抑制冠状HIV物理性质并在病理上到底有效，这个重要关键问题尚并未受益充分对此。
之前药作为治疗冠状HIV所引发得病因的有效治疗，但由于缺乏人体内或人体内的种系统数据归纳，其发展与合理用于外受到了阻挠。为了明确之前药的潜在抑制 SARS-CoV-2 活性，我们从常用之前药之前抽样了多种肉桂分开出物，并从之前药用药液 RDS(加拿大一种零售业性牛奶处方药) 之前见到了抑制 SARS-CoV 和抑制 SARS-CoV-2 HIV的活性，一种在加拿大的零售业牛奶处方药。RDS 常用增强生物体呼吸种系统的某种程度健康，其包分作多种肉桂混搭物，如籽和景天，它们是基本上上常用操控增生和腹腔得病因的之前肉桂 (11-13)。在此，我们另据 RDS 对 SARS-CoV、SARS-CoV-2 骗HIV以及十分相似传染性的野生型 SARS-CoV-2 HIV对靶肝细胞的传染十分相似诱发效用。我们大幅度检验 RDS 可通过反之亦然灭活HIV微粒或阻拦HIV侵入而诱发HIV的更早传染预期。此外，我们见到 RDS 还可以阻拦当季流HIV对靶肝细胞的传染。这些相比较，RDS 对肺部HIV的传染或许十分相似较广的诱发效用。
▋结果
为了从基本上之前肉桂之前找到潜在的抑制 SARS-CoV-2 活性，我们从大约四十种基本上肉桂之前抽样分开出出 SARS-CoV-2S 复合物骗型极快HIV[14,15] 和生物体腹腔 A549(ACE2) 靶肝细胞，此生物 ACE2 测序但会通过极快HIV转导作为小分子依赖性，从而稳定转导来实现超传达。极快骗型HIV用于黄色荧光复合物 (GFP) 或荧光亦同酶 (Luc) 作为另据测序，并通过了十分相似广谱抑制HIV进入可抑剂型，以及萨拉多尔 (Arbidol)[16]，和生物抑制毒血清对抑制 SARS-CoV-2(左图 1a、C) 的检验。我们需要成功样品到萨拉多尔 (Arbidol) 和抑制毒血清对于 SARS-CoV-2 骗型HIV的诱发效用，这是我们在其他四十余种基本上肉桂分开出物检测之前没有见到的，除此以外其之前一些实际上较高致癌的肉桂 (左图 1a-C)。然而，鉴于极快性骗型HIV仅能样品 SARS-CoV-2 HIV的侵入犯罪行为，我们不可排除这些肉桂分开出物或许有在进入后阶段需要诱发 SARS-CoV-2 的风险。我们大幅度从基本上药物破除肺毒用药液 (RDS) 之前抽样出了或许的抑制 SARS-CoV-2 活性，该电子产品分作有九种肉桂混搭物——、籽、籽、景天、玄参、苦杏仁、蜂房、皂角、醋，在之前国基本上上常用治疗腹腔得病因 (11-13)。
分作有当季基咖啡硫、3，4-二邻咖啡酰钠盐硫、当季基 3，4-二邻咖啡酰钠盐硫、原儿茶硫、当季基绿原硫和冬青草亦同；而但会之前还分作有乙酰 A、B 和 10 种值得注意环内酯醚芳香烃乙酰[17]；该真菌还分作有皂甙甙 A 和 B，以及抑制增生效用的乙酰 C[18,19]。籽酯乙酰之前分作有木脂亦同、松脂酚籽乙酰[20]。籽之前分作有被叫作籽皂乙酰的甾体皂乙酰，是籽属真菌相异的真菌化学物质[21,22]。细叶景天之前主要活性混搭物为四种单芳香烃，(−)-蜂蜜内酯、(+)-普莱格内酯、(−)-柠檬内酯和 (+)-蜂蜜呋喃；这种真菌还分作有其他引申物，如 1-辛内酯-3-醇、3-辛内酯、β-香草内酯和β-石竹内酯[23]。玄参分作有高达 162 种引申物，除此以外环内酯醚芳香烃和环内酯醚芳香烃乙酰、苯丙乙酰、有机硫、芳香烃类、脂类、黄内酯类、和皂乙酰[24]。苦杏仁之前分作有苯当季硫、氰基引申物和果胶多糖[25]。皂角刺之前分作有皂乙酰和羽扇豆硫[26,27]，而醋之前分作有主要活性混搭物醋硫[28]。为了大幅度检测 RDS 的抑制 SARS-CoV-2 活性，用相同混和沸点的 RDS 预检视 A549(ACE2) 肝细胞，然后让这些肝细胞在实际上 RDS 的意味著接纳 4-6 时长的传染。传染后，在不实际上 RDS 的意味著指导肝细胞，然后在 48 和 72 时长的时候，通过流型式肝细胞精对HIV传染的诱发效用顺利进行分析。为了操控肝细胞致癌，用于氟化丙啶 (PI) 对即将遇害和已遇害的肝细胞顺利进行颜料，仅在活肝细胞群之前归纳 GFP+肝细胞。如左图 2 标明，我们掩蔽到 RDS 对 SARS-CoV-2(GFP) 骗HIV十分相似副效用反之亦然诱发效用。为了属实这些结果，我们用于内源性传达 ACE2 的 VeroE6 肝细胞重复了该传染科学研究研究。
(见下页左图)
ACE2 内部传达，其实质 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 HIV可对其顺利进行传染，ACE2 不一定常用冠状HIV的数据归纳 (7)。考虑到在缺乏 ACE2 超传达 [15，29，30] 的意味著，骗型HIV对 VeroE6 的传染性低，我们还用于了荧光亦同酶另据测序骗型HIV，该HIV的另据测序传达由 HIV-1LTR 和 Tat 驱动，十分相似低的另据测序敏感性和信噪比。
左图 2：RDS 诱发 SARS-CoV-2(GFP) 骗型HIV传染 A549(ACE2) 肝细胞。
A.A549(ACE2) 肝细胞用 RDS 周内混和 30 分钟后，用 SARS-CoV-2(GFP) 骗型HIV传染。将肝细胞浴去HIV和 RDS，并在不实际上 RDS 的意味著顺利进行指导。流型式肝细胞郭子样品HIV传染诱发或许。并未传染的肝细胞和传染 SARS-CoV-2(GFP) 但并未经 RDS 治疗的肝细胞作为相比较。GFP+肝细胞百分比已辨识。(PI) 氟化丙啶。
B.RDS 的肝细胞致癌计量。A549(ACE2) 肝细胞用 RDS 周内混和 4 时长，浴去 RDS，无 RDS 指导 48 时长。氟化丙啶颜料检查和刚刚遇害肝细胞和已遇害肝细胞，流型式肝细胞精归纳。插图副效用-中间体肝细胞致癌曲率，RDS 的半无故沸点 (LC50) %为 1:11.9。
如左图 3A 标明，我们用于 Luc 报告测序骗HIV和 VeroE6 肝细胞顺利进行传染科学研究研究，掩蔽到 RDS 对该HIV传染十分相似副效用反之亦然诱发效用，并且半数诱发沸点明确为 1:230RDS 混和度 (左图 3B)。我们还分析了 RDS 对 VeroE6 肝细胞活力的反之亦然影响，明确了 50% 肝细胞遇害副效用为 1:11.8RDS 混和度。
左图 3：RDS 对 SARS-CoV-2(Luc) 骗HIV和野生型 SARS-CoV-2 HIV的副效用反之亦然诱发诱发效用。用 RDS 周内混和预检视 A、BVeroE6 肝细胞，并用 SARS-CoV-2(Luc) 骗型HIV传染。将肝细胞浴去HIV和 RDS，并在不实际上 RDS 的意味著顺利进行指导。在传染后 72 时长用荧光亦同酶样品HIV传染的诱发效用。并未传染肝细胞和 SARS-CoV-2-luc 传染但并未经过 RDS 治疗的肝细胞作为相比较。科学研究研究重复三次。插图副效用中间体曲率和 RDS 的 I-C50 混和%为 1:230。CRDS 对 VeroE6 肝细胞的肝细胞致癌也通过氟化丙啶颜料和流型式肝细胞精计量。用 RDS 周内混和 4 时长，浴去 RDS，在不分作 RDS 的意味著指导 72 时长。插图肝细胞致癌副效用-中间体曲率，RDS 的半无故沸点 (LC50) %为 1:13.8 混和。DRDS 诱发传染性 SARS-CoV-2 传染。用周内混和的 RDS 预检视 VeroE6 肝细胞，并在 RDS 实际上的意味著传染 SARS-CoV-2。传染 48 时长后，通过凶菌斑归纳HIV释放后的HIV拷贝诱发或许。诱发科学研究研究一型式合计五顺利进行，并在 Prism7(Graph Pad) 之前用于单向权重 (One-Way ANOVA) 归纳及 Dunnett 后检查和 (Dunnett's Post Test)，借以明确统计数字显着性。显著性值用上标指出如下：*p
为了大幅度检验用于骗HIV给予的结果，我们检测了 RDS 对于 SARS-CoV-2 传染的阻挠传染性潜能。如左图 3D 标明，RDS 同时也阻挠了 SARS-CoV-2 对 VeroE6 肝细胞的传染。RDS 在混和 1:40 以上时可显著减少HIV淡褐色的形成。
综上，通过 SARS-CoV-2 骗HIV与传染性HIV的相比较，RDS 分作有诱发 SARS-CoV-2 传染的活性混搭物，或许是通过反之亦然灭活HIV或阻挠HIV的更早传染预期。
为大幅度数据归纳或许的前提，我们将传染性 SARS-CoV-2 HIV微粒与周内混和的 RDS 在 37°C 下预指导 1 时长。随后，将固体大幅度分别为混和-(10–1 至 10–4)，并投身于 Vero 肝细胞顺利进行凶菌斑归纳以明确HIV传染性的增加。如左图 4A 标明，我们掩蔽到在 RDS 之前短暂暴露一时长后的HIV微粒，其 SARS-CoV-2 的传染效价也排列成副效用反之亦然降低。该结果属实了 RDS 可有效反之亦然灭活 SARS-CoV-2 HIV微粒的传染性。
我们大幅度检测了 RDS 到底也能诱发 SARS-CoV-2 HIV变型的传染。为此，我们并用最近开发新的混搭当季HIV-SARS-CoV-2 骗型HIV (Ha-CoV-2)[31] 来混搭物一两部 S 复合物见下文，除此以外英国见下文 (B.1.1.7)，南非见下文 (B.1.351)，乌拉圭见下文 (P.1)，俄勒冈州见下文 (B.1.429)，和其他几个取而代之兴见下文 (B.1.2，B.1.494，B.1.1.207B.1.258，B.1.1.298)。Ha-CoV-2(Luc) 和特别 S 复合物相异体在 37°C 周内混和 RDS 指导 1 时长。随后，用该固体传染 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 靶肝细胞。传染后 12 时长，荧光亦同酶校准HIV传染的诱发效用。如左图 4B 标明，我们还掩蔽到了 RDS 对 Ha-CoV-2(Luc) 和所有 S 复合物见下文的副效用反之亦然诱发。
我们还检测了 RDS 阻挠 SARS-CoV 传染的潜能，用于十分相似 SARS-CoV 突刺复合物的 GFP 另据测序极快HIV和[15] 逆副效用。我们将人 A549(ACE2) 肝细胞用作靶肝细胞，将其用两部混和的 RDS 预检视，然后用 SARS-CoV(GFP) 报告测序骗HIV传染 4-6 时长。传染后在不分作 RDS 的意味著指导肝细胞，流型式肝细胞精分析样品其对HIV传染的诱发效用。同样，用于氟化丙啶排除刚刚遇害与已遇害的肝细胞，仅在活肝细胞群之前归纳 GFP+肝细胞。如左图 5A 标明，我们掩蔽到 RDS 对 SARS-CoV(GFP) 骗型HIV的诱发效用排列成副效用反之亦然。我们大幅度属实了这些结果，并分析了 RDS 依赖性的诱发与 Luc 另据测序 SARS-CoV 骗型HIV，SARSCoV(Luc)。我们掩蔽到 RDS 对 SARS-CoV(Luc) 和的诱发效用排列成副效用性依赖于，其半诱发沸点 (IC50) 为 1:70.88 混和度 (左图 5B，C)。考虑到 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 都用于 ACE2 传染靶肝细胞，我们还检测了 RDS 的抑制HIV活性到底仅针对与 ACE2 有相互效用的冠状HIV。为此，我们样品了一种不特别的负链 RNA HIV便是乙型肺炎HIV。它通过HIV血凝亦同 (HA) 和肝细胞α-唾液硫来传染靶肝细胞。为了混搭物乙型肺炎HIV，将传达乙型肺炎 A/WSN/33(H1N1) 测序组每个片段的 8 个小分子和一个 GFP-另据测序合计转染到 HEK293T 肝细胞之前。在 RDS 实际上的意味著，采集HIV微粒并常用传染目标 MDCK 肝细胞。如左图 6A 标明，我们掩蔽到 RDS 对乙型肺炎HIV的诱发效用排列成副效用反之亦然。RDS 在 1:40 和 1:80 混和时可基本上阻挠HIV传染，在 1:160 混和时则可部分诱发乙型肺炎。RDS 对 MDCK 肝细胞的半无故沸点 (LC50) 经校准为 1:18.5(左图 6B)。这些相比较，RDS 的抑制HIV活性并非针对特定HIV，而或许需要较广诱发多种肺部HIV，如冠状HIV和乙型肺炎HIV。
▋提问
在本报告之前，我们检验了基本上药物破除肺毒用药液 (RDS) 分作有广谱抑制HIV活性，可阻挠 SARS-CoV、SARSCoV-2 和乙型肺炎HIV的传染。虽然 RDS 需要诱发多种HIV，但其抑制HIV活性因HIV类别和菌株而异。例如，对 SARS-CoV 极快骗HIV的 I-C50 沸点为 1:7.9 混和度，对 SARS-CoV-2 极快骗HIV的 I-C50 沸点为 1:230 混和度。对于传染性野生型 SARS-CoV-2 HIV，I-C50 为 1:40 混和度，对乙型肺炎，其 I-C50 为 1:250。RDS 对 Ha-CoV-2 及其变型有相同的诱发效用，IC50 值从 1:70 到 1:2601 混和度不等 (左图 4B)。
(见下一页左图)
左图 4 RDS 对 SARS-CoV-2 和引申的 Ha-CoV-2 变型十分相似副效用反之亦然灭活效用。ASARS-CoV-2 微粒加周内混和的 RDS 在 37°C 下指导 1 时长。随后，将固体大幅度周内混和，并投身于 Vero 肝细胞之前顺利进行凶菌斑归纳，以明确HIV传染性增加。诱发科学研究研究一型式合计五顺利进行，并在 Prism7(GraphPad) 之前用于单向权重 (One-WayANOVA) 归纳和 Dunnett 后检查和 (Dunnett'sPostTest) 借以明确统计数字显着性。显著性值用上标指出如下：*p
BHa-CoV-2(Luc) 和特别 S 复合物见下文与周内混和的 RDS 在 37°C 指导 1 时长后，用固体传染 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 靶肝细胞。传染后 12 时长，荧光亦同酶校准HIV传染的诱发效用。RDS 的 IC50 值的混和度为 1:177(wt)，1:828(B.1.1.7)，1:124(B.1.351)，1:88(P.1)，1:134(B.1.1.207)，1:2601(B.1.1.298)，1:70(B.1.258)，1:362(B.1.429)，1:163(B.1.494)，1:137(B.1.2)。
我们大幅度检验了 RDS 可以诱发冠状HIV的更早传染预期。虽然具体的抑制HIV前提尚并未清楚，但 RDS 可以通过反之亦然灭活HIV微粒或通过阻拦HIV侵入或阻挠HIV侵入后的更早预期来阻拦HIV传染。在其他几种基本上之前药之前也见到了抑制 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 的活性。例如，一种常见的基本上之前药——醋。
醋根之前已检验分作有醋硫亦同，可诱发 SARS HIV[32] 病理分开株的拷贝。此外，另一种可常用治疗肺部得病因的之前药——双黄连剂型，已辨识出在人体内以副效用反之亦然方型式为诱发 SARS-CoV-23CL 复合物酶 (3CLpro) 活性。铁线莲乙酰和铁线莲亦同拟作为双黄连阻挠 3CLpro[33] 的有效混搭物。
左图 5 RDS 诱发 SARS-CoV 骗型HIV对 A549(ACE2) 肝细胞的传染。用周内混和的 RDS 预检视 A、B 肝细胞，用 SARS-CoV(GFP)(A) 或 SARSCoV(Luc)B 骗型HIV传染。将肝细胞清浴，省略HIV和 RDS，在不实际上 RDS 的意味著顺利进行指导。在传染后 48 时长和 72 时长，通过流型式肝细胞精或荧光亦同酶样品来计量HIV传染的诱发效用。科学研究研究重复三次。插图副效用积极响应曲率，并插图 RDS 的 IC50 值为 1:70.9 混和度 (C)
左图 6 RDS 诱发当季流HIV对 MDCK 肝细胞的传染。(A) 用周内混和的 RDS 预检视 MDCK 肝细胞 30 分钟，然后用当季流HIV (GFP) 对其顺利进行传染。传染后，在 RDS 实际上下指导肝细胞。36 时长后用流型式肝细胞郭子对HIV传染的诱发效用顺利进行计量。把并未传染的肝细胞与被当季流HIV (GFP) 传染但并未经 RDS 检视的肝细胞顺利进行对比。左图之前辨识了 GFP+肝细胞的百分比。PI 指出氟化丙啶 PI。
(B) 另外还用于了 MTT 校准法计量了 RDS 对 MDCK 肝细胞的致癌，插图了肝细胞致癌的副效用-中间体曲率，经计算，RDS 的半数无故沸点为 1:18.5 混和度 RDS 的有效抑制HIV混搭物尚并未明确。然而，RDS 相同于铁线莲乙酰和铁线莲亦同，RDS 可以通过反之亦然灭活HIV原子来阻挠HIV传染 (左图 4)，而铁线莲乙酰和铁线莲亦同则在HIV生命周期的中期通过阻挠HIV复合物酶的活性来发挥效用。然而，RDS 的人体内抑制 SARS-CoV-2 活性仍需在今后的动物数据归纳和生物病理科学研究研究之前受益属实。目前，我们刚刚顺利进行小型动物科学研究研究，以明确 RDS 在人体内阻挠 SARS-CoV-2 HIV传染的潜力。
▋结论
我们的数据归纳指出，RDS 可较广诱发肺部HIV的传染，如 SARS-CoV、SARS-CoV-2 和乙型肺炎。
▋步骤
肝细胞和肝细胞指导
HEK293T (ATCC 博拉米尔，特拉华州) MDCK (ATCC 博拉米尔，特拉华州)，VeroE6 (ATCC 博拉米尔，特拉华州) 和 A549 (ACE2) (来自 Virongy LLC 借给，博拉米尔，特拉华州)，和 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) (来自 Virongy LLC 借给，博拉米尔，特拉华州) 目前保存于 Dulbecco's modifiedEagle's medium (DMEM) (赛默飞世尔生物科技 Thermo Fisher Scientific) 分作有 10% 高热灭活 FBS 和 1×衍生物-链霉亦同 (赛默飞世尔生物科技 Thermo Fisher Scientific)。在 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 肝细胞指导基之前分别以 1μg/ml 和 200μg/ml 的沸点投身于嘌呤霉亦同和潮霉亦同 B。
细胞核转染和HIV混搭物
分作 SARS-CoVS 复合物或 SARS-CoV-2S 复合物的极快性骗型HIV微粒由 Virongy LLC (Manassas，VA) 合计享，或按照下面揭示的步骤[15] 混搭物。简言之，为了混搭物 GFP 另据测序极快性骗HIV，HEK293T 肝细胞与传达 SARS-CoVS 复合物或 SARS-CoV-2S 复合物的小分子、pCMVΔR8.2 和 pLKO.1-puro-TurboGFP 合计转染。为了产出荧光亦同酶另据测序极快性骗型HIV，将 HEK293T 肝细胞与传达 SARSCoVS 复合物或 SARS-CoV-2S 复合物的小分子、pCMVΔR8.2 和 pLTR-Tat-IRES-Luc 顺利进行合计转染。转染后 48 时长采集HIV上清液，离心浓缩，−80℃ 保存。野生型 SARS-CoV-2 HIV (Isolate USA-WA1/2020) 由 BEI Bioresources (Manassas，VA) 合计享。pHW-NAGFP (ΔAT6) 报告测序细胞核和 A/WSN/1933 H1N1 引申细胞核 pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-PA、pHW2000-HA、pHW2000-NP、pHW2000-NA、pHW20000M 由 FengLi 麻省理工学院友善合计享。在肺炎HIV A-GFP 另据测序原子混搭物之前，将 pHW2000-pb2、pHW2000-pb1、pHW2000-PA、pHW2000-ha、pHW2000-np、pHW2000-na、pHW2000-m、pHW2000-ns 和 pHW-NA-GFP 合计转染 HEK293T 肝细胞 (ΔAT6)。48 时长后采集HIV上清液。SARS-CoV-2S、M、E、N 传达小分子转售 Sinobiological。并用 Twist Bioscience 合成了 Ha-CoV-2(Luc) 小分子和 S 复合物相异小分子。Ha-CoV-2(Luc) 和 S 复合物相异原子按照下面揭示步骤[31] 顺利进行混搭物。
HIV传染和药物诱发科学研究研究
RDS(破除肺毒用药液)(来自 Dejia Harmony 借给，利斯堡，特拉华州) 是由马麻省理工学院麻省理工学院 (Burnaby，BC，Canada) 生产的一种零售业电子产品。RDS 之前所有之前肉桂混搭物外符合《之前国中药 2015 年版》「饮片」标准，除此以外有效混搭物分作量及重金属、化肥纪念版样品。RDS 是一种之前药的合计煎剂，再次产物在汽化有条件下挥发。SARS-CoV-2 抑制血清由 LanceA. Liotta 医生合计享。将萨拉朵尔盐硫盐 (Sigma) 重取而代之悬浮在苯当季硫 (Sigma) 之前。对于骗型HIV传染，12 孔板之前的 A549(ACE2) 肝细胞 (来自 Virongy LLC 借给，博拉米尔，特拉华州) 或 VeroE6 肝细胞用 RDS 预检视 30 分钟，在 37℃ 下传染 4-6 时长，然后在可口指导基之前干净指导 48-72 时长。对于 VeroE6 肝细胞的传染，肝细胞也被 CoV-2 骗型HIV传染增强剂 (CoV-2PIE) (来自 Virongy LLC 借给，博拉米尔，特拉华州) 预检视后，在 37°C 下再检视 30 分钟。用于 GloMaxDiscover 酶标郭子 (Promega) 归纳肝细胞裂解物的荧光亦同酶活性。对于野生型 SARS-CoV-2 传染，VeroE6 肝细胞在 37°C 下用 RDS 预检视 30 分钟，然后用 MOI 为 0.05 传染 SARS-CoV-2 (Isolate USA-WA1/2020；BEI Bioresources) 在威廉米切尔的学校的 BSL-3 收容设施内滞留 1 时长。肝细胞用 PBS 干净 2 次，用分作 RDS 的指导基指导 48 时长。从上清之前分开出HIV，用 12 孔板指导的 Vero 肝细胞单层之前的凶菌斑科学研究研究校准小瓶滴度。简言之，每个样品在零碎的 Dul-becco's ModifiedEagle 指导基 (VWR) 之前混搭物，包分作 1X 衍生物-链霉亦同 (VWR)，并移除 10% 的 FBS(赛默飞世尔生物科技 Thermo Fisher Scientific)。然后将 200 微升的每种混和液吸附到 VeroE6 肝细胞单层的三个横向孔上 1 时长。然后用 1～2 ml0.6% 琼脂糖 (Invitrogen) 和一部分零碎的 Eagle Minimal Essential 指导基 (VWR) 的固体覆盖单层，分作 1X 衍生物-链霉亦同，并移除 10%FBS。48 时长后，将单层膜固定在 10% 当季醛溶液之前 1 时长，并移除覆盖的琼脂纳。为了颜料淡褐色，投身于分作有 20% 乙醇的 1% 结晶紫精油溶液 5 分钟，然后用去离子水干净。对于乙型肺炎HIV传染 MDCK 肝细胞，在 37°C 下用 RDS 预检视 30 分钟，然后用 A-GFP 另据测序HIV传染 6 时长。用分作 RDS 的指导基干净肝细胞，指导 36 时长。GFP 传达通过流型式肝细胞郭子计量。(FACSCalibur，BD Biosciences).
对于 SARS-CoV-2 HIV微粒的 RDS 灭活科学研究研究，将 100μl 周内混和的 RDS 移除到 1 mlSARS-CoV-2 HIV原液 (3.65×105PFU/ml) 之前，再次 RDS 混和为 1:20，1:40 或 1:80。也除此以外相比较有条件 (1 ml HIV+100μl 指导基)。固体在 37°C 下指导 1 时长。随后，对固体顺利进行两部混和以产生额外的 1:10、1:100、1:1,000 和 1:10,000 混和度，并将周内混和的样品投身于 12 孔板之前的 Vero 肝细胞之前，常用顺利进行凶菌斑校准归纳。淡褐色校准之前再次的 RDS 混和度为 1:200 至 1:200,000；1:400 到 1:400,000；和 1:800 到 1:800,000 的 RDS 混和液。
Ha-CoV-2(Luc) 和 S 复合物相异原子按照下面揭示的步骤[31] 混搭物。对于 Ha-CoV-2(Luc) 的 RDS 灭活，将 5μl 周内混和的 RDS 移除到 45μlHa-CoV-2(Luc) 或见下文之前，再次 RDS 混和度为 1:20、1:40、1:80、1:160 或 1:320。将固体在 37°C 下指导 1 时长，然后在 RDS 实际上下传染 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 肝细胞 12 时长。用于 GloMax Discover 酶标郭子 (Promega) 归纳肝细胞裂解物的荧光亦同酶活性。
肝细胞致癌归纳样品
用氟化丙啶颜料和流型式肝细胞精分析对 A549 (ACE2) 肝细胞和 VeroE6 肝细胞的药物肝细胞致癌顺利进行样品，如所述 (34)。用于肝增生试剂盒 I(MTT) (Sigma) 和制造商建言的可行性对 MDCK 肝细胞的药物致癌顺利进行分析。简言之，将 MDCK 肝细胞 (ATCC) 以每孔 1×-105 个肝细胞的速度疫苗接种到 12 孔板之前。肝细胞指导隔夜后，通过 RDS 检视 1 天，然后在 MTT 标识试剂 (Sigma) 的指导基之前指导。将肝细胞与标识试剂合计同指导 4 时长，再后续投身于 MTT 增溶液。指导皿孵育过夜，用 GloMax Discover 酶标郭子 (Promega) 校准吸星等。
缩写
SARS-CoV：比较严重急性呼吸种系统综合症特别冠状HIV；SARSCoV-2：Severe 比较严重急性呼吸种系统综合症特别冠状HIV-2；TCM：基本上之前药；RDS：肺部排毒用药液；Ha-CoV-2：混搭乙型取而代之冠HIV骗HIV。
来向
感谢 FengLi 合计享肺炎HIV传达小分子，感谢 LanceLiotta 合计享抑制毒血清；感谢 TedCi，HeSun，ZhigangGao，WanyingWu 的提问与建言；感谢 KevinCarter、MarkMamdar、RichKeurajian、KarenFreidouni 合计享 RDS 和肉桂分开出物。
原作者贡献
此次科学研究研究由 Y.W.，R.H. 和 L.A.H. 设计，由 Y.W. 编辑，由 L.A.H. 编者。B.H.，D.Y.，A.A.O.，L.D.C.，S.H.，D.D、GA 及 YM 执行了该科学研究研究。所有原作者已阅读并批准再次校对。
补助
本数据归纳的补助来自于威廉米切尔的学校内部拨出 223741(DeJiaHarmony/Anti-SARS-CoV-2)，该赔偿金由德佳和畅 (DeJiaHarmony) 合计享。
数据和涂层的可用性
本数据归纳之前产生或归纳的所有数据外包分作在本文之前。试剂可从 Y.W 处受益。
声明
批准及参与同意
不适用
同意月初出版
不适用
公平竞争商业利益
威廉米切尔的学校国家政府生物抵御和狂犬得病之前心的 RMH 和 YW 已给予了德佳和畅 (DejiaHarmony) 的数据归纳资助，LAH 为德佳和畅担任顾问并给予了酬金。没有其他人关系或活动或许但会反之亦然影响到送交的工作。
原作者请注意
1加拿大特拉华州威廉米切尔的学校种系统生物学学院国家政府生物抵御和狂犬得病之前心，博拉米尔 20110。
2VirongyLLC，特拉华州博拉米尔。3加拿大孙子纳比，BCV5J0E5 马麻省理工学院麻省理工学院 (Dr.Ma's LaboratoriesInc.)。4 加拿大特拉华州利斯堡筹备但会议科学研究组织，20176。
收稿月初份：2021 年 4 月初 7 日
接纳月初份：2021 年 5 月初 10 日
线上月初出版时间：2021 年 5 月初 29 日
概述
1. Zhu N, Zhang D, Wang W, Li X, Yang B, Song J, et al. A Novel Coronirus from Patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med. 2020;382(8):727–33.
2. Wu Y, Ho W, Huang Y, Jin D, Li S, Liu S, et al. SARS-CoV-2 is an appropriate name for the new coronirus. Lancet. 2020;395(10228):949–50.
3. Gorbalenya AE, Baker SC, Baric RS, de Groot RJ, Drosten C, Gulyaeva AA, et al. Coroniridae Study Group of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Nat Microbiol. 2020;5:536–44.
4. Drosten C, Günther S, Preiser W, van der Werf S, Brodt H-R, Becker S, et al. Identification of a novel coronirus in patients with severe acute respiratory syndrome. N Engl J Med. 2003;348(20):1967–76.
5. Ksiazek TG, Erdman D, Goldsmith CS, Zaki SR, Peret T, Emery S, et al. A novel coronirus associated with severe acute respiratory syndrome. N Engl J Med. 2003;348(20):1953–66.
6. Peiris JSM, Lai ST, Poon LLM, Guan Y, Yam LYC, Lim W, et al. Coronirus as a possible cause of severe acute respiratory syndrome. Lancet. 2003;361(9366):1319–25.
7. Zhou P, Yang X-L, Wang X-G, Hu B, Zhang L, Zhang W, et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronirus of probable bat origin. Nature. 2020;579(7798):270–3.
8. Wu F, Zhao S, Yu B, Chen Y-M, Wang W, Song Z-G, et al. A new coronirus associated with human respiratory disease in China. Nature. 2020;579(7798):265–9.
9. Yang Y, Islam MS, Wang J, Li Y, Chen X. Traditional Chinese medicine in the treatment of patients infected with 2019-new coronirus (SARS-CoV-2): a review and perspective. Int J Biol Sci. 2020;16(10):1708–17.
10. Ling CQ. Traditional Chinese medicine is a resource for drug discovery against 2019 novel coronirus (SARS-CoV-2). Journal Integr Medicine. 2020;18(2):87–8.
11. Shan M-Q, Qian Y, Yu S, Guo S-C, Zhang L, Ding A-W, et al. Anti-inflammatory effect of volatile oil from Schizonepeta tenuifolia on carrageenininduced pleurisy in rats and its application to study of appropriate harvesting time coupled with multi-attribute comprehensive index method. J Ethnopharmacol. 2016;194:580–6.
12. Jung ID, Kim HY, Park JW, Lee CM, Noh KT, Kang HK, et al. RG-II from Panax ginseng C.A. Meyer suppresses asthmatic reaction. BMB Reports. 2012;45(2):79–84.
13. Wu W, Li R, Li X, He J, Jiang S, Liu S, et al. Quercetin as an antiviral agent inhibits influenza A virus (IAV) entry. Viruses. 2015;8(1):6. doi. org/
10. 3390/ v8010 006. 14. Belouzard S, Chu VC, Whittaker GR. Activation of the SARS coronirus spike protein via sequential proteolytic cleage at two distinct sites. Proc Natl Acad Sci USA. 2009;106(14):5871–6.
15. He S, Waheed AA, Hetrick B, Dabbagh D, Akhrymuk IV, Kehn-Hall K, et al. PSGL-1 inhibits the incorporation of SARS-CoV and SARS-CoV-2 spike glycoproteins into pseudovirus and impairs pseudovirus attachment and infectivity. Viruses. 2021;13(1):46. doi. org/ 10. 3390/ v1301 0046.
16. Boriskin YS, Leneva IA, Pecheur EI, Polyak SJ. Arbidol: a broad-spectrum antiviral compound that blocks viral fusion. Curr Med Chem. 2008;15(10):997–1005.
17. Kakuda R, Imai M, Yaoita Y, Machida K, Kikuchi M. Secoiridoid glycosides from the flower buds of Lonicera japonica. Phytochemistry. 2000;55(8):879–81.
18. Son KH, Jung KY, Chang HW, Kim HP, Kang SS. Triterpenoid saponins from the aerial parts of Lonicera japonica. Phytochemistry. 1994;35(4):1005–8.
19. Kwak WJ, Han CK, Chang HW, Kim HP, Kang SS, Son KH. Loniceroside C, an antiinflammatory saponin from Lonicera japonica. Chem Pharm Bull. 2003;51(3):333–5.
20. Din LB, Bedgar DL, Katayama T, Lewis NG. On the stereoselective synthesis of (+)-pinoresinol in Forsythia suspensa from its achiral precursor, coniferyl alcohol. Phytochemistry. 1992;31(11):3869–74.
21. Kim YS, Woo JY, Han CK, Chang IM. Safety ysis of panax ginseng in randomized clinical trials: a systematic review. Medicines. 2015;2(2):106–26.
22. Attele AS, Wu JA, Yuan CS. Ginseng pharmacology: multiple constituents and multiple actions. Biochem Pharmacol. 1999;58(11):1685–93.
23. Yu S, Chen Y, Zhang L, Shan M, Tang Y, Ding A. Quantitative comparative ysis of the bio-active and toxic constituents of lees and spikes of Schizonepeta tenuifolia at different harvesting times. Int J Mol Sci. 2011;12(10):6635–44.
24. Ren D, Shen Z-y, Qin L-p, Zhu B. Pharmacology, phytochemistry, and traditional uses of Scrophularia ningpoensis Hemsl. J Ethnopharmacol. 2021;269:113688.
25. Sefer F, Misirli A, Gülcan R, editors. A RESEARCH ON PHENOLIC AND CYANOGENIC COMPOUNDS IN SWEET AND BITTER KERNELLED APRICOT VARIETIES. 2006: International Society for Horticultural Science (ISHS), Leuven, Belgium.
26. Chong W, Feng XY, Zhen GZ, Dan L, Yue D. Inhibition of mast cell degranulation by saponins from Gleditsia sinensis–structure-activity relationships. Nat Prod Commun. 2009;4(6):777–82.
27. Li WH, Zhang XM, Tian RR, Zheng YT, Zhao WM, Qiu MH. A new anti-HIV lupane acid from Gleditsia sinensis Lam. J Asian Nat Prod Res. 2007;9(6–8):551–5.
28. Nazari S, Rameshrad M, Hosseinzadeh H. Toxicological effects of Glycyrrhiza glabra (Licorice): a review. Phytother Res. 2017;31(11):1635–50.
29. Meltzer B, Dabbagh D, Guo J, Kashanchi F, Tyagi M, Wu Y. Tat controls transcriptional persistence of unintegrated HIV genome in primary human macrophages. Virology. 2018;518:241–52.
30. Wang Z, Tang Z, Zheng Y, Yu D, Spear M, Iyer SR, et al. Development of a nonintegrating Rev-dependent lentiviral vector carrying diphtheria toxin A chain and human TRAF6 to target HIV reservoirs. Gene Ther. 2010;17(9):1063–76.
31. Hetrick B, He S, Chilin LD, Dabbagh D, Alem F, Narayanan A, et al. Development of a novel hybrid alphirus-SARS-CoV-2 particle for rapid in vitro screening and quantification of neutralization antibodies, viral variants, and antiviral drugs. bioRxiv 2020. doi. org/ 10. 1101/ 2020. 12. 22. 423965.
32. Cinatl J, Morgenstern B, Bauer G, Chandra P, Rabenau H, Doerr HW. Glycyrrhizin, an active component of liquorice roots, and replication of SARS-associated coronirus. Lancet. 2003;361(9374):2045–6.
33. Su H-x, Yao S, Zhao W-f, Li M-j, Liu J, Shang W-j, et al. Anti-SARS-CoV-2 activities in vitro of Shuanghuanglian preparations and bioactive ingredients. Acta Pharmacologica Sinica. 2020;41(9):1167–77.
34. Crowley LC, Scott AP, Marfell BJ, Boughaba JA, Chojnowski G, Waterhouse NJ. Measuring cell death by Propidium Iodide uptake and flow cytometry. Cold Spring Harb Protoc. 2016. doi. org/ 10. 1101/ pdb. prot0 87163.
编者： 翟超男相关新闻
相关问答
